ALCAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419076-ACT

Alcam codifica a molécula de adesão celular de leucócitos ativados (ALCAM/CD166), um receptor da superfamília das imunoglobulinas que medeia interações homofílicas e heterofílicas para regular a adesão célula–célula, a migração e a organização tecidual durante o desenvolvimento do camundongo e na homeostase do adulto. A ALCAM participa de processos ligados à remodelação do citoesqueleto e à dinâmica das junções, influenciando a integridade epitelial, o direcionamento de axônios e o tráfego de células imunes. Por meio de sua sinalização dependente de adesão, a ALCAM pode modular vias que controlam proliferação e diferenciação, incluindo efeitos dependentes do contexto sobre a saída de sinalização de MAPK e PI3K-AKT. A expressão desregulada de ALCAM tem sido associada a alterações em propriedades do tipo tronco, invasão e comportamento metastático em diversos modelos de doença, tornando-a um ponto útil para estudar a plasticidade fenotípica impulsionada por adesão.

ALCAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Alcam sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALCAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Alcam em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Alcam, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALCAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Alcam nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALCAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALCAM em células tumorais com expressão de Alcam silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.