AKAP 79 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402647-ACT

Humanes AKAP5 kodiert das A‑Kinase‑Ankerprotein 79 (AKAP 79), ein membranassoziiertes Scaffold-Protein, das PKA zusammen mit zentralen Signalenzymsystemen wie PP2B/Calcineurin und PKC räumlich organisiert und so stimulusabhängige Phosphorylierungen prägt. Durch die Verankerung dieser Komplexe in der Nähe von Rezeptoren und Ionenkanälen reguliert AKAP 79 kompartimentierte cAMP‑ und Ca2+-abhängige Signalübertragung, synaptische Plastizität sowie das aktivitätsabhängige Remodeling exzitatorischer Synapsen. AKAP‑79-assoziierte Signalwege beeinflussen die Funktion von AMPA- und NMDA-Rezeptoren und nachgeschaltete Transkriptionsprogramme, die die neuronale Erregbarkeit steuern. Eine Fehlregulation AKAP5-gekoppelter Signal-Hubs wurde mit Mechanismen neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, bei denen veränderte synaptische Signalübertragung und ein verschobenes Gleichgewicht der Ca2+/cAMP-Signalwege zur Pathophysiologie beitragen.

AKAP 79 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AKAP5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AKAP 79 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AKAP5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AKAP5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AKAP 79-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AKAP5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AKAP 79-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AKAP 79-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AKAP5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.