Imunoprecipitação/Western Blots
- Prepare o lisado celular total como descrito no protocolo 1 para os procedimentos de Western Blot.
- Limpe o lisado celular completo (passo opcional) da seguinte maneira: Para aproximadamente 1 ml de lisado celular completo ou extrato de tecidos (Veja as tabelas Lisados Celulares Totais ou Extratos de Tecidos), acrescente 0.25 µg do controle IgG apropriado (correspondente à espécie hospedeira do anticorpo primário; veja IgGs controle e Conjugados IgG), junto com 20 µl do conjugado suspenso de agarose apropriado (25% v/v) (Proteína A-Agarose, Proteína G-Agarose, Proteína A/G-Agarose, ou Proteína L-Agarose). Incube à temperatura de 4° C por 30 minutos.
- Faça um pellet com as "beads" através de centrifugação à 3.000 rpm ( (aproximadamente 1.000xg) durante 30 segundos à temperatura de 4° C. Transfira o sobrenadante (lisado celular) para um novo tubo de microcentrífuga à temperatura 4° C.
- Para 1 ml lisado celular acima, ou aproximadamente 100–1000 µg de proteína celular total , acrescente 10 µg de conjugado de agarose do anticorpo primário(isto é, 5 µl de volume das " packed beads") e incube à temperatura de 4° C durante o período de mínimo de 1 hora a durante a noite sob agitação.
- Opcionalmente, se o conjugado de agarose do anticorpo primário não estiver disponível, incube 1 ml do lisado celular 1–10 µl (ou seja, 0.2–2 µg) do anticorpo primário (a concentração ideal do anticorpo deverá ser determinada por titulação) durante 1–2 horas à temperatura de 4° C. Acrescente 20 µl da suspensão do conjugado de agarose apropriado (Proteína A-Agarose, Proteína G-Agarose, Proteína A/G-Agarose ou Proteína L-Agarose). Feche os tubes e incube à temperatura de 4° C numa plataforma de agitação ou aparelho de rotação pelo período mínimo de 1 hora a durante a noite
- Colete o pellet através de centrifugação à 3.000 rpm (aproximadamente 1.000xg) por 30 segundos à temperatura de 4° C. Aspire cuidadosamente e despreze o sobrenadante.
- Lave o pellet 2–4 vezes com a solução-tampāo RIPA (sc-24948) (solução mais pesada) ou PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais) (solução mais leve), e repetir o passo de centrifugação acima a cada vez.
- Depois da última lavagem, aspire e despreze o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 40 µl de solução-tampão 2x para eletroforese (sc-24945).
- Ferva as amostras por 2–3 minutos. Coloque entre 5–10 µl de amostra por poço de 1.0 mm de largura para géis de 0.75 mm espessura.
- Continue com a eletroforese e imunoblotting como descrito no protocolo 1 dos procedimentos para Western blotting.
OBSERVAÇÃO: Dependendo do anticorpo secundário utilizado, as cadeias de IgG pesadas e leves com respectivamente 55 kDa e 27 kDa do anticorpo primário poderão ser detectadas. Essas bandas serão menos evidentes, quando for utilizado um conjugado de agarose de anticorpo primário no procedimento descrito acima, ou ainda, se forem utilizados os reagentes ImmunoCruz™ IP/WB Optima.