Zic3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407048-ACT

ZIC3 kodiert den Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Zic3, ein nukleäres DNA-bindendes Protein, das die frühe embryonale Musterbildung und die Festlegung der Links-Rechts-Achse reguliert. Zic3 moduliert genregulatorische Netzwerke, die an der Mesendodermbildung, der neuralen Entwicklung und der zilienabhängigen Signalgebung beteiligt sind, welche sich während der Morphogenese mit Signalwegen wie NODAL/SMAD und WNT verzahnt. Eine fehlregulierte ZIC3-Expression oder -Funktion ist mit Lateralisationsdefekten und kongenitalen Fehlbildungen assoziiert und macht ZIC3 zu einem geeigneten Knotenpunkt für die Untersuchung entwicklungsbiologischer Transkriptionsprogramme. In menschlichen Zellmodellen liefert ZIC3 ein gut handhabbares Readout zur Untersuchung der Linienspezifizierung, der chromatinstatengesteuerten Kontrolle entwicklungsrelevanter Loci und der durch Transkriptionsfaktoren getriebenen Umverdrahtung von Netzwerken.

Zic3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZIC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Zic3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZIC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZIC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Zic3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZIC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Zic3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Zic3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZIC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.