Plasmide CRISPR d'Activation (h) vinculin: sc-400227-ACT

Le gène humain VCL code la vinculine, un adaptateur mécanosensible de liaison à l’actine, enrichi au niveau des adhérences focales et des jonctions d’adhérence, où elle couple les complexes d’intégrines et de cadhérines au cytosquelette d’actine. La vinculine régule la dynamique des adhésions cellule–MEC et cellule–cellule, la transmission des forces et le remodelage du cytosquelette via des voies impliquant la taline, la paxilline, la signalisation FAK/Src et les GTPases de la famille Rho. En ajustant le renouvellement des adhésions et les forces de traction, VCL influence la migration, la polarité et la morphogenèse tissulaire, et sa dérégulation est étudiée dans des contextes d’invasivité accrue et de potentiel métastatique. La mécanotransduction dépendante de VCL est également pertinente dans des modèles d’adhérence des cardiomyocytes et de couplage contractile, où des altérations de l’intégrité jonctionnelle peuvent affecter les réponses au stress.

vinculin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VCL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

vinculin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VCL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VCL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de vinculin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VCL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de vinculin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie vinculin dans les cellules tumorales présentant une expression de VCL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.