Plasmide CRISPR d'Activation (h) VGAT: sc-401850-ACT

SLC32A1 code le transporteur vésiculaire du GABA (VGAT), une protéine membranaire des vésicules synaptiques qui charge le GABA et la glycine dans les vésicules de sécrétion afin de permettre la neurotransmission inhibitrice. En contrôlant l’absorption vésiculaire et la taille quantale, VGAT régule l’équilibre excitation–inhibition, la plasticité synaptique et les oscillations des réseaux neuronaux dans l’ensemble du système nerveux central. Une signalisation inhibitrice altérée, liée à une dérégulation de l’activité de SLC32A1/VGAT, est pertinente pour les études sur l’épilepsie, les phénotypes associés à l’anxiété, les troubles neurodéveloppementaux et les troubles du mouvement, où l’inhibition au niveau des circuits est perturbée. En tant que transporteur vésiculaire, la fonction de VGAT s’inscrit à l’interface du cycle des vésicules synaptiques, du métabolisme des neurotransmetteurs et des processus de transport dépendants des gradients ioniques qui façonnent l’efficacité des synapses inhibitrices.

VGAT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC32A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VGAT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC32A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC32A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VGAT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC32A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VGAT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VGAT dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC32A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.