Plasmide CRISPR d'Activation (m) UNC45A: sc-430401-ACT

Unc45a code UNC45A, une chaperonne conservée orientée vers la myosine, qui coopère avec HSP90 pour favoriser le repliement correct, la stabilité et l’assemblage fonctionnel des protéines motrices de type myosine. En régulant la contractilité actomyosine et l’organisation du cytosquelette, UNC45A contribue à des processus tels que le transport intracellulaire, la division cellulaire et la migration cellulaire. Dans des systèmes murins, une perturbation de l’activité d’UNC45A peut affecter la morphogenèse des tissus et la mécanique cellulaire en modifiant l’homéostasie des protéines motrices et les voies de protéostasie. Une expression ou une fonction dérégulée d’UNC45A a été associée dans la littérature à des défauts du cytosquelette ainsi qu’à des phénotypes prolifératifs ou migratoires aberrants, ce qui étaye sa pertinence pour des études mécanistiques du comportement cellulaire lié aux maladies.

UNC45A Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Unc45a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UNC45A Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Unc45a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Unc45a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UNC45A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Unc45a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UNC45A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UNC45A dans les cellules tumorales présentant une expression de Unc45a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.