UBE2S CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404140-ACT

UBE2S (Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 S) ist ein E2-Ubiquitin-konjugierendes Enzym, das K11-verknüpfte Polyubiquitin-Ketten verlängert und dabei mit dem Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosom (APC/C) zusammenarbeitet, um eine zeitgerechte Ubiquitinierung und den Abbau von Zellzyklusregulatoren zu fördern. Durch diese Aktivität trägt UBE2S zur Koordination des mitotischen Fortschreitens, zur Erfüllung des Spindelkontrollpunkts und zum geordneten Austritt aus der Mitose bei und unterstützt damit Genomstabilität und kontrollierte Proliferation. Eine fehlregulierte UBE2S-Expression oder -Aktivität wurde in mehreren Krankheitskontexten mit aberranter Proteostase und gestörter Zellzykluskontrolle in Verbindung gebracht, darunter Krebserkrankungen, in denen ein Umbau von Ubiquitin-Signalwegen häufig ist. Als Knotenpunkt der ubiquitinabhängigen Signalübertragung wird UBE2S zudem genutzt, um das Crosstalk zwischen APC/C-Funktion, proteasomvermitteltem Proteinabbau und stressresponsiven Signalwegen zu untersuchen, die Zellschicksalsentscheidungen beeinflussen.

UBE2S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2S-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBE2S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2S-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2S-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBE2S-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2S-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBE2S-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBE2S-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2S-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.