Plásmido CRISPR de Activación (m) tsg 101: sc-423524-ACT

Tsg101 codifica el gen de susceptibilidad tumoral 101, un componente central del complejo ESCRT-I que coordina la clasificación endosomal, la biogénesis de cuerpos multivesiculares y el tráfico dependiente de ubiquitina de proteínas de membrana. En células de ratón, tsg101 contribuye a las vías de degradación lisosomal, a la regulación a la baja de receptores y a eventos de remodelación de membranas vinculados con la citocinesis y la autofagia. A través de su papel en la escisión de membranas mediada por ESCRT, Tsg101 influye en la biogénesis de exosomas y en la gemación viral, procesos que se aprovechan con frecuencia en modelos de infección y señalización intercelular. La disfunción de ESCRT y la expresión alterada de Tsg101 se han asociado, en sistemas experimentales, con proliferación celular aberrante, inestabilidad genómica y fenotipos oncogénicos, lo que lo hace relevante para el estudio de la biología celular relacionada con el cáncer.

tsg 101 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Tsg101 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

tsg 101 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Tsg101 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Tsg101, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de tsg 101. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Tsg101 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de tsg 101 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía tsg 101 en células tumorales con expresión de Tsg101 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.