Thrombospondin 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423381-ACT

Thbs1 kodiert Thrombospondin 1, ein sezerniertes matricelluläres Glykoprotein, das Zell–Matrix-Interaktionen moduliert und das extrazelluläre Mikromilieu umgestaltet. In Mausgeweben beeinflusst THBS1 die Angiogenese und die vaskuläre Homöostase, unter anderem durch Interaktionen mit CD36 und Integrinen sowie durch die Regulation der Aktivierung latenter TGF-β-Signalwege. Es prägt Zelladhäsion, Migration und entzündliche Wechselwirkungen und verknüpft die Dynamik der extrazellulären Matrix mit Programmen der Wundheilung und des Gewebeumbaus. Eine fehlregulierte THBS1-Expression wurde mit Fibrose, Tumor–Stroma-Interaktionen und vaskulären Pathologien in Verbindung gebracht, was THBS1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung mikroumgebungsabhängiger Phänotypen macht.

Thrombospondin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Thbs1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thrombospondin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Thbs1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Thbs1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thrombospondin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Thbs1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thrombospondin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thrombospondin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Thbs1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.