Plasmide CRISPR d'Activation (h) TCP-1 η: sc-403833-ACT

CCT7 code la sous-unité TCP-1 η (CCTη) du complexe chaperonine cytosolique contenant TCP-1 (CCT/TRiC), une machine de repliement dépendante de l’ATP indispensable à la maturation de protéines structurellement complexes telles que l’actine et la tubuline. En soutenant l’assemblage du cytosquelette, la protéostasie et le contrôle qualité, CCT/TRiC influence la progression du cycle cellulaire, le trafic intracellulaire et les réponses au stress, notamment via des interactions avec les voies ubiquitine–protéasome. Une activité chaperonine dérégulée a été associée à des programmes d’homéostasie protéique altérés observés dans des contextes de maladies prolifératives et neurodégénératives, faisant de CCT7 un nœud utile pour étudier des phénotypes dépendants du repliement. Dans les cellules humaines, la perturbation de l’expression de CCT7 peut révéler comment la capacité des chaperonnes limite la dynamique du cytosquelette et les réseaux de signalisation qui dépendent de protéines clientes correctement repliées.

TCP-1 η Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCT7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TCP-1 η Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCT7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCT7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TCP-1 η. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCT7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TCP-1 η au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TCP-1 η dans les cellules tumorales présentant une expression de CCT7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.