TCF-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423299-ACT

Das murine Tcf7 kodiert den Transkriptionsfaktor TCF-1, ein DNA-bindendes High-Mobility-Group-(HMG)-Protein, das als zentraler Effektor des kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalwegs fungiert. TCF-1 koordiniert Genexpressionsprogramme, die die Festlegung der Lymphozytenlinie, die Thymozytendifferenzierung und die Aufrechterhaltung stammzellähnlicher Zustände von T-Zellen steuern, mit nachgeschalteten Effekten auf Zytokinsignalisierung und metabolische Anpassung. In immunologischen und entwicklungsbiologischen Kontexten integriert TCF-1 Signalinputs, um die Chromatinzugänglichkeit und transkriptionelle Netzwerke zu regulieren, die Zellschicksalsentscheidungen prägen. Eine fehlregulierte TCF-1-abhängige Transkription wurde mit veränderter Immunhomöostase und onkogenen Transkriptionsprogrammen in Verbindung gebracht, wie sie in Modellen hämatologischer Malignome untersucht werden.

TCF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tcf7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tcf7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tcf7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tcf7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tcf7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.