SMPDL3B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404724-ACT

O SMPDL3B humano (sphingomyelin phosphodiesterase acid-like 3B) codifica uma proteína associada à membrana ancorada por GPI, com homologia a enzimas relacionadas à esfingomielinase, e está implicado na regulação da homeostase de esfingolipídios e de lipídios de membrana. Ao influenciar a composição lipídica e a organização de microdomínios, o SMPDL3B pode modular a sinalização de receptores, o tráfego de vesículas e as saídas de sinalização da imunidade inata em células mieloides e outros tipos celulares. Alterações na expressão de SMPDL3B têm sido associadas na literatura a fenótipos imunes e inflamatórios e vêm sendo investigadas em contextos como a biologia de doenças renais e metabólicas, em que remodelamento lipídico e sinalização imune se intersectam. Essas características tornam o SMPDL3B um alvo útil para estudar mecanismos de sinalização próximos à membrana e a regulação, dirigida por lipídios, dos estados de ativação celular.

SMPDL3B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMPDL3B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SMPDL3B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMPDL3B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMPDL3B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SMPDL3B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMPDL3B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SMPDL3B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SMPDL3B em células tumorais com expressão de SMPDL3B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.