Plasmide CRISPR d'Activation (h) SGLT-2: sc-402074-ACT

SLC5A2 code le cotransporteur sodium–glucose SGLT-2, un transporteur de la membrane apicale qui couple les gradients de Na⁺ à une réabsorption du glucose de grande capacité, classiquement au niveau des tubules rénaux proximaux. En contrôlant le flux transépithélial de glucose, SGLT-2 établit un lien entre le transport ionique, l’énergétique cellulaire et l’équilibre osmotique, et son expression est coordonnée avec la polarisation épithéliale et les réseaux de transporteurs de solutés. Une activité altérée de SLC5A2 est pertinente pour les phénotypes de prise en charge rénale du glucose et pour l’homéostasie glucidique systémique, ce qui en fait une cible utile pour étudier la régulation métabolique. En outre, SGLT-2 constitue un modèle de protéine membranaire facilement exploitable pour étudier la biogenèse des transporteurs, leur trafic et les dynamiques conformationnelles couplées au substrat.

SGLT-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC5A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SGLT-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC5A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC5A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SGLT-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC5A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SGLT-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SGLT-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC5A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.