Plasmide CRISPR d'Activation (h) PMCA1: sc-402691-ACT

ATP2B1 code pour l’ATPase Ca2+ 1 de la membrane plasmique humaine (PMCA1), une pompe d’efflux du Ca2+ à haute affinité qui rétablit un faible taux de calcium cytosolique après des événements de signalisation. En exportant le Ca2+ vers l’espace extracellulaire, PMCA1 module l’amplitude et la durée des voies dépendantes du Ca2+ qui régulent l’excitabilité membranaire, la sécrétion, la dynamique du cytosquelette et les programmes transcriptionnels. L’activité de PMCA1 s’intègre à une régulation dépendante de la calmoduline et à des effecteurs en aval tels que les CaMK et la voie calcineurine/NFAT afin de maintenir l’homéostasie cellulaire du Ca2+. Une dérégulation de la gestion du calcium impliquant ATP2B1 a été associée, dans des études génétiques et fonctionnelles, à des phénotypes cardiovasculaires et neurobiologiques, ce qui étaye sa pertinence pour la recherche mécanistique sur les processus pathologiques induits par le calcium.

PMCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP2B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PMCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP2B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP2B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PMCA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP2B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PMCA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PMCA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP2B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.