Plásmido CRISPR de Activación (h) NOXA: sc-400498-ACT

PMAIP1 codifica NOXA, un miembro proapoptótico de la familia BCL2 con dominio BH3 exclusivo que promueve la permeabilización de la membrana externa mitocondrial al antagonizar de forma preferente a MCL1 y otras proteínas antiapoptóticas relacionadas. NOXA se induce rápidamente por señales de estrés celular, incluidas las respuestas al daño del ADN dependientes de p53, e integra la apoptosis con la proteostasis y la señalización asociada a la hipoxia. Al desplazar el equilibrio de las interacciones de la familia BCL2, NOXA influye en la activación de caspasas, la integridad mitocondrial y las decisiones sobre el destino celular. La expresión desregulada de PMAIP1/NOXA se ha vinculado con una alteración del “apoptotic priming” en biología del cáncer y con fenotipos de respuesta al estrés relevantes para la neurodegeneración y contextos inflamatorios.

NOXA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PMAIP1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NOXA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PMAIP1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PMAIP1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NOXA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PMAIP1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NOXA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NOXA en células tumorales con expresión de PMAIP1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.