Plásmido CRISPR de Activación (h) myotubularin: sc-403912-ACT

MTM1 codifica la miotubularina, una fosfatasa lipídica que desfosforila el fosfatidilinositol 3-fosfato y el fosfatidilinositol (3,5)-bisfosfato, regulando así la señalización de fosfoinosítidos en compartimentos endosomales y de tráfico de membranas. Mediante el control de la endocitosis, la dinámica de membranas relacionada con la autofagia y la organización del citoesqueleto, la miotubularina ayuda a mantener la arquitectura celular y la homeostasis de los orgánulos. En el músculo esquelético, la actividad de MTM1 está estrechamente vinculada a las vías de remodelación de membranas necesarias para la integridad de las miofibras y el soporte de la excitación–contracción. Las variantes con pérdida de función en MTM1 se asocian con la miopatía miotubular ligada al cromosoma X, lo que impulsa estudios mecanísticos del recambio de fosfoinosítidos y de la biología de las células musculares.

myotubularin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MTM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

myotubularin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MTM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MTM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de myotubularin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MTM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de myotubularin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía myotubularin en células tumorales con expresión de MTM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.