Plasmide CRISPR d'Activation (h) MLKL: sc-401248-ACT

La MLKL humaine (mixed lineage kinase domain-like protein) est un effecteur central de la nécroptose, agissant en aval de la signalisation RIPK1/RIPK3 pour induire une mort cellulaire inflammatoire et lytique. Après phosphorylation par RIPK3, MLKL subit une activation conformationnelle, s’oligomérise et se relocalise vers les membranes cellulaires, où elle perturbe l’intégrité membranaire et favorise la libération de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP). Cette voie s’articule avec les réponses immunitaires innées, la signalisation des cytokines et le dialogue entre modes de mort cellulaire régulée, notamment avec l’apoptose et la pyroptose, modulant ainsi l’inflammation tissulaire et la défense de l’hôte. Une activité MLKL dérégulée et une signalisation nécroptotique anormale ont été impliquées dans des modèles de processus inflammatoires et neurodégénératifs, de lésions ischémiques et de biologie du microenvironnement tumoral, faisant de MLKL un nœud utile pour les études mécanistiques.

MLKL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MLKL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MLKL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MLKL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MLKL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MLKL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MLKL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MLKL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MLKL dans les cellules tumorales présentant une expression de MLKL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.