Plasmide CRISPR d'Activation (h) LysRS: sc-404110-ACT

KARS code la lysyl‑tRNA synthétase humaine (LysRS), une enzyme cytosolique essentielle qui charge le tRNALys en lysine afin d’assurer la fidélité de la traduction et une synthèse protéique efficace. En reliant la disponibilité des acides aminés au fonctionnement du ribosome, LysRS contribue à la protéostasie et aux réponses intégrées au stress, et a été impliquée dans des rôles de signalisation non canoniques qui coordonnent l’adaptation cellulaire au stress. Une activité altérée des aminoacyl‑tRNA synthétases a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, à des neuropathies périphériques et à des troubles liés aux mitochondries et/ou à la traduction, faisant de KARS un point d’intérêt pertinent pour l’étude des relations génotype–phénotype. KARS est donc largement utilisé dans des études mécanistiques du contrôle de la traduction, de la régulation de la croissance cellulaire et des voies associées au stress.

LysRS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KARS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LysRS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KARS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KARS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LysRS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KARS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LysRS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LysRS dans les cellules tumorales présentant une expression de KARS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.