HSPA8/HSC70 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418508-ACT

HSPA8 kodiert das Heat-Shock-Cognate-Protein mit 71 kDa (HSC70), ein konstitutiv exprimiertes Chaperon der HSP70-Familie, das die Proteostase unterstützt, indem es das ATP-abhängige Falten, Refalten und den Transport von Client-Proteinen vermittelt. HSC70 ist an der clathrinvermittelten Endozytose beteiligt, an der chaperonvermittelten Autophagie über die Erkennung von LAMP2A sowie an Proteinqualitätskontrollwegen, die mit dem Ubiquitin-Proteasom-System und der Dynamik von Stressgranula verknüpft sind. Durch die Regulation des Umgangs mit neu synthetisierten Polypeptiden, des Proteinimports in Organellen und von Chaperon–Cochaperon-Netzwerken beeinflusst HSPA8 das Zellüberleben unter proteotoxischem und metabolischem Stress. Eine Fehlregulation der HSC70-zentrierten Proteostase wird mit Neurodegeneration, der Stressanpassung von Krebszellen und der Biologie viraler Infektionen in Verbindung gebracht, was HSPA8 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien von Stress- und Transportwegen macht.

HSPA8/HSC70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPA8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSPA8/HSC70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPA8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPA8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSPA8/HSC70-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPA8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSPA8/HSC70-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSPA8/HSC70-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPA8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.