Plasmide CRISPR d'Activation (h) GKLF/KLF4: sc-400312-ACT

KLF4 (GKLF) code un facteur de transcription à doigts de zinc qui régule les décisions de destinée cellulaire en coordonnant des programmes contrôlant la prolifération, la différenciation et l’intégrité de la barrière épithéliale. Dans les cellules humaines, KLF4 intègre des signaux issus de voies telles que TGF-β/SMAD, Wnt/β-caténine, Notch et MAPK afin de moduler les points de contrôle du cycle cellulaire, les réponses au stress et l’expression génique spécifique de lignée. C’est un composant clé de la reprogrammation des cellules somatiques et il influence l’accessibilité de la chromatine via des interactions avec des co-régulateurs transcriptionnels. Une activité dérégulée de KLF4 a été associée à une altération de l’homéostasie épithéliale, à la signalisation inflammatoire et à des rôles dépendants du contexte dans la transformation oncogénique et la suppression tumorale.

GKLF/KLF4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KLF4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GKLF/KLF4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KLF4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KLF4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GKLF/KLF4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KLF4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GKLF/KLF4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GKLF/KLF4 dans les cellules tumorales présentant une expression de KLF4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.