Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCN2: sc-402313-ACT

EIF2AK4 code GCN2, une kinase sérine/thréonine qui détecte la limitation en acides aminés en se liant à des ARNt non chargés et qui couple le stress nutritionnel au contrôle de la traduction. Lorsqu’elle est activée, GCN2 phosphoryle eIF2α afin d’initier la réponse intégrée au stress (ISR), remodelant la synthèse protéique globale tout en favorisant des programmes de traduction sélectifs qui soutiennent l’adaptation au stress métabolique et oxydatif. Cette signalisation recoupe l’autophagie, l’homéostasie mitochondriale et des sorties transcriptionnelles liées à l’immunité via des voies dépendantes d’ATF4. Une activité altérée d’EIF2AK4/GCN2 a été étudiée dans des contextes d’adaptation au stress nutritionnel, d’inflammation et de survie des cellules tumorales, ce qui en fait une cible pertinente pour disséquer les dépendances à la signalisation du stress dans des modèles cellulaires humains.

GCN2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF2AK4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCN2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF2AK4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF2AK4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCN2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF2AK4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCN2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCN2 dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF2AK4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.