Plásmido CRISPR de Activación (h) GAD-67: sc-400588-ACT

GAD1 codifica la descarboxilasa del glutamato 67 (GAD-67), una enzima dependiente de fosfato de piridoxal que cataliza la conversión de L‑glutamato en ácido γ‑aminobutírico (GABA), lo que respalda la neurotransmisión inhibitoria y el equilibrio entre excitación e inhibición en el sistema nervioso central humano. GAD-67 contribuye a las reservas citosólicas de GABA en interneuronas GABAérgicas y se asocia con la función sináptica, las oscilaciones de las redes neuronales y el acoplamiento metabólico dependiente de la actividad. La expresión alterada de GAD1/GAD-67 se ha vinculado a la disrupción de la señalización GABAérgica observada en múltiples afecciones neuropsiquiátricas y del neurodesarrollo, lo que la convierte en un objetivo clave para estudios mecanísticos. La modulación experimental de GAD1 se utiliza comúnmente para investigar la fisiología de los circuitos inhibitorios, la homeostasis de neurotransmisores y la regulación transcripcional en modelos neuronales.

GAD-67 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GAD1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GAD-67 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GAD1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GAD1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GAD-67. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GAD1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GAD-67 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GAD-67 en células tumorales con expresión de GAD1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.