FOG CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402620-ACT

Das humane ZFPM1 kodiert Friend of GATA-1 (FOG), einen transkriptionellen Kofaktor mit mehreren Zinkfingerdomänen, der an Proteine der GATA-Familie bindet und so linienspezifische Genprogramme moduliert. FOG koordiniert aktivierende und reprimierende Chromatinkomplexe, einschließlich NuRD/HDAC-assoziierter Maschinerie, um die erythroide und megakaryozytäre Differenzierung sowie die umfassendere hämatopoetische Entwicklung zu regulieren. Aufgrund seiner Kontrolle über Transkriptionsnetzwerke, die die Festlegung des Zellschicksals steuern, wird ZFPM1 häufig in Signalwegen untersucht, die Hämatopoese, Thrombozytenbiologie und entwicklungsbezogene Genregulation prägen. Eine dysregulierte ZFPM1/FOG-Aktivität und ein verändertes Gleichgewicht von GATA-Kofaktoren sind relevant für eine fehlerhafte hämatopoetische Differenzierung und entsprechende Forschungsmodelle zu Blut- und Entwicklungsstörungen.

FOG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZFPM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FOG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZFPM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZFPM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FOG-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZFPM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FOG-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FOG-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZFPM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.