Plasmide CRISPR d'Activation (h) Filamin 3: sc-402897-ACT

FLNB code la filamine 3, une protéine d’échafaudage se liant à l’actine, qui réticule la F‑actine et couple le cytosquelette aux récepteurs membranaires ainsi qu’aux complexes de signalisation. La filamine 3 contribue à coordonner la forme cellulaire, l’adhérence et la mécanotransduction en organisant des voies liées à l’engagement des intégrines, à la dynamique des adhésions focales et à la signalisation des GTPases de la famille Rho. Par ces fonctions, elle influence le remodelage du cytosquelette, la migration cellulaire et l’architecture tissulaire au cours du développement et de l’homéostasie. Une activité de FLNB dérégulée ou une organisation altérée du réseau cytosquelettique a été associée à des anomalies du développement et à des modifications, pertinentes pour la maladie, de la mécanique cellulaire, ce qui justifie son étude dans les contextes de la biologie musculosquelettique et du cancer.

Filamin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FLNB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Filamin 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FLNB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FLNB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Filamin 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FLNB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Filamin 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Filamin 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de FLNB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.