Plasmide CRISPR d'Activation (h) FAK: sc-400089-ACT

La protéine tyrosine kinase 2 (PTK2) code la focal adhesion kinase (FAK), une tyrosine kinase non réceptrice qui coordonne les signalisations des intégrines et des récepteurs de facteurs de croissance au niveau des adhérences focales afin de réguler l’adhérence cellulaire, la migration, la survie et la mécanotransduction. FAK intègre les signaux issus de l’interaction avec la matrice extracellulaire et du remodelage du cytosquelette via des voies comprenant notamment PI3K/AKT, MAPK/ERK, la signalisation des GTPases Rho et le renouvellement des adhérences focales. En raison de ses rôles dans la transition épithélio-mésenchymateuse, l’invasion et la signalisation dépendante de l’ancrage, une activité altérée de PTK2/FAK est fréquemment étudiée dans des contextes tels que la progression tumorale et la biologie des métastases, ainsi que la fibrose et le remodelage tissulaire inflammatoire. Sa position centrale dans la signalisation dépendante de l’adhérence fait de PTK2 une cible largement utilisée pour disséquer la motilité cellulaire et les phénotypes induits par le microenvironnement.

FAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FAK dans les cellules tumorales présentant une expression de PTK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.