Dynein HC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400919-ACT

DYNC1H1 codifica a cadeia pesada 1 da dineína citoplasmática, um motor direcionado para a extremidade menos dos microtúbulos que impulsiona o transporte de longa distância de vesículas, organelos, mRNAs e complexos proteicos. A atividade da cadeia pesada da dineína sustenta a organização do fuso mitótico, o posicionamento do centrossoma, o tráfego de endossomas/lisossomas e o transporte axonal retrógrado, por meio de interações coordenadas com a dinactina e adaptadores de carga. Como componente central da maquinaria de transporte do citoesqueleto, DYNC1H1 é essencial para a manutenção neuronal e para a logística intracelular que molda a polaridade, a proteostase e as respostas ao stress. Alterações genéticas em DYNC1H1 têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuromusculares, tornando-o relevante para estudos de axonopatia, vulnerabilidade de neurónios motores e sinalização dependente de transporte.

Dynein HC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DYNC1H1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dynein HC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DYNC1H1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DYNC1H1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dynein HC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DYNC1H1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dynein HC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dynein HC em células tumorais com expressão de DYNC1H1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.