DNase II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405046-ACT

O DNASE2 humano codifica a DNase II, uma endonuclease ácida lisossomal que degrada DNA derivado de células apoptóticas, de núcleos engolfados e de outras fontes extracelulares ou vesiculares após a fagocitose. Ao eliminar DNA dentro de compartimentos endolisossomais, a DNase II ajuda a manter a homeostase de ácidos nucleicos e limita a ativação aberrante do reconhecimento imune inato e de vias inflamatórias de sinalização a jusante. A interrupção ou desregulação da atividade de DNASE2 tem sido associada a depuração deficiente de DNA, aumento de programas de genes estimulados por interferon e fenótipos inflamatórios relevantes para autoimunidade e estresse hematológico. Assim, a função da DNase II é amplamente estudada no contexto de apoptose, eferocitose, biologia dos lisossomos e regulação imune mediada por ácidos nucleicos.

DNase II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DNASE2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNase II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DNASE2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DNASE2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNase II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DNASE2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNase II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNase II em células tumorais com expressão de DNASE2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.