Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol ε A: sc-402290-ACT

POLE code la sous-unité catalytique A de l’ADN polymérase ε, une polymérase réplicative à haute fidélité essentielle à la synthèse de l’ADN du brin directeur et à la progression de la phase S. L’ADN polymérase ε participe à la stabilité de la fourche de réplication, se coordonne avec le complexe hélicase CMG et contribue au mécanisme intrinsèque de relecture exonucléase 3′→5′, qui limite les erreurs de réplication. Par son rôle dans la réplication de l’ADN et le maintien du génome, POLE s’articule avec la signalisation de la réponse aux dommages de l’ADN et les voies du stress réplicatif qui préservent l’intégrité chromosomique. Une altération de la fonction ou de la régulation de POLE est associée à une augmentation de la charge mutationnelle et à des phénotypes d’instabilité génomique, fréquemment examinés dans des études portant sur les défauts de réplication associés au cancer et la dépendance à la réparation de l’ADN.

DNA pol ε A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol ε A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol ε A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol ε A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol ε A dans les cellules tumorales présentant une expression de POLE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.