DD4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403692-ACT

O AKR1C4 humano codifica a DD4, uma aldo-ceto redutase dependente de NADPH que catalisa a redução de hormonas esteroides e de substratos carbonílicos reativos. A DD4 atua de forma proeminente no metabolismo hepático de esteroides e de ácidos biliares, contribuindo para a desintoxicação e para a homeostase redox através da regulação da interconversão de cetoesteroides. Ao modular os níveis de androgénios, progestagénios e outros intermediários esteroides, o AKR1C4 influencia programas transcricionais dependentes de hormonas e redes de sinalização metabólica. Alterações na expressão ou na atividade do AKR1C4 têm sido associadas a um metabolismo esteroide desregulado e a fisiopatologia hepática, sustentando a sua relevância em estudos da biologia das doenças metabólicas e da resposta a xenobióticos.

DD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AKR1C4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AKR1C4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AKR1C4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DD4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AKR1C4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DD4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DD4 em células tumorais com expressão de AKR1C4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.