Plasmide CRISPR d'Activation (h) DAP12: sc-400916-ACT

TYROBP code la protéine 12 activant DNAX (DAP12), un adaptateur transmembranaire contenant un motif ITAM, qui couple les récepteurs activateurs des cellules myéloïdes et lymphoïdes à la signalisation en aval. DAP12 s’associe à des récepteurs tels que TREM2, SIRPβ1 et certains récepteurs des cellules NK afin de favoriser la phosphorylation de SYK/ZAP70 et d’activer les voies PI3K, MAPK et NF-κB, lesquelles régulent la phagocytose, la production de cytokines, le burst oxydatif et la survie cellulaire. Dans la microglie et les macrophages, la signalisation dépendante de TYROBP façonne l’activation de l’immunité innée, le métabolisme des lipides et l’élimination des débris cellulaires, ce qui la relie aux processus neuro-inflammatoires et à la dysrégulation immunitaire. Des altérations de la signalisation TYROBP/DAP12 ont été associées à des phénotypes inflammatoires et liés à la neurodégénérescence, ce qui en fait une cible utile pour étudier les réseaux de signalisation récepteur–adaptateur dans les cellules immunitaires humaines.

DAP12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TYROBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DAP12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TYROBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TYROBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DAP12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TYROBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DAP12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DAP12 dans les cellules tumorales présentant une expression de TYROBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.