Plasmide CRISPR/Cas9 KO Cytokeratin 15 (m): sc-421340

Présentation

Krt15 code la cytokératine 15 (K15), une protéine de filament intermédiaire de type I enrichie dans les compartiments épithéliaux basaux, notamment la région du bulge du follicule pileux et les épithéliums stratifiés. K15 s’intègre aux réseaux de filaments de kératine avec les kératines de type II afin de soutenir l’architecture cellulaire, la résistance mécanique et la polarité lors de l’homéostasie épithéliale. Son expression est étroitement associée aux états progéniteurs et de type « cellule souche » de l’épithélium et elle est régulée de façon dynamique au cours de la réparation des plaies, de la différenciation et de programmes de remodelage qui recoupent l’organisation du cytosquelette et le maintien des jonctions cellule–cellule. Les modifications des profils d’expression de K15 sont utilisées pour étudier une régénération épithéliale dérégulée et la plasticité de lignée dans des contextes tels que l’altération de la barrière cutanée, des défauts du cycle du follicule pileux et des modèles de néoplasie épithéliale.

Le Cytokeratin 15 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Krt15 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Krt15, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Cytokeratin 15 plasmide HDR (m) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Krt15 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Cytokeratin 15 CRISPR/Cas9 KO (m):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Krt15.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Krt15 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons Krt15 essentiels à la fonction Cytokeratin 15
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.