cyclin E2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402500-ACT

CCNE2 codifica a ciclina E2, uma ciclina regulatória que se liga à CDK2 e a ativa para promover a transição G1/S e o início da replicação do DNA. A ciclina E2 integra sinais mitogênicos ao controle dos checkpoints do ciclo celular ao modular a fosforilação de substratos a jusante envolvidos no disparo das origens de replicação e na entrada na fase S. A expressão desregulada de CCNE2 pode comprometer a estabilidade do genoma e as respostas ao estresse replicativo, tornando-a relevante para estudos de sinalização proliferativa, tolerância a danos no DNA e programas transcricionais associados ao ciclo celular. Assim, CCNE2 é amplamente utilizada como uma ferramenta molecular para investigar redes dependentes de CDK2, o timing do ciclo celular e mecanismos que acoplam o controle da replicação a modelos de transformação oncogênica.

cyclin E2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCNE2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cyclin E2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCNE2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCNE2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cyclin E2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCNE2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cyclin E2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cyclin E2 em células tumorais com expressão de CCNE2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.