connexin 26 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402132-ACT

GJB2 kodiert Connexin 26, ein vierfach transmembranöses Gap-Junction-Protein, das sich zu hexameren Hemikanälen und interzellulären Kanälen zusammenlagert und so den direkten Zell-zu-Zell-Transfer von Ionen und kleinen Metaboliten vermittelt. Connexin 26 unterstützt die Homöostase epithelialer und sensorischer Gewebe, indem es elektrische Kopplung, Calcium-Signalisierung und metabolische Synchronisation koordiniert; unter bestimmten physiologischen Bedingungen übernimmt es über Hemikanäle zudem zusätzliche Funktionen bei der ATP-Freisetzung und parakrinen Kommunikation. Dieses Protein ist ein zentraler Bestandteil von Gap-Junction-Kommunikationsnetzwerken, die Differenzierung, Barrierefunktion und Stressantworten beeinflussen. Genetische Variation in GJB2 ist stark mit hereditärem Hörverlust assoziiert und wird außerdem mit syndromischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die Haut und Hautanhangsgebilde betreffen, wodurch es ein breit untersuchtes Gen in der Hörbiologie und Epithelphysiologie ist.

connexin 26 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GJB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

connexin 26 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GJB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GJB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen connexin 26-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GJB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von connexin 26-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des connexin 26-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GJB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.