Plasmide CRISPR d'Activation (h) claudin-8: sc-404251-ACT

CLDN8 code la claudine‑8, une protéine tétraspan des jonctions serrées qui régule la perméabilité paracellulaire et l’intégrité de la barrière épithéliale. La claudine‑8 contribue à l’organisation du complexe jonctionnel apical et à l’étanchéité sélective aux ions dans les épithéliums polarisés, en s’intégrant à des voies qui contrôlent la polarité cellulaire, l’adhésion et le transport transépithélial. Une expression modifiée de CLDN8 ou une altération de sa localisation jonctionnelle est associée à des dysfonctionnements épithéliaux et à des processus de remodelage observés dans les troubles inflammatoires et dans des modifications des propriétés de barrière liées au cancer. En tant que composant jonctionnel, la claudine‑8 est largement utilisée comme marqueur et comme point d’entrée mécanistique pour étudier la différenciation épithéliale et la régulation, spécifique des tissus, de la perméabilité.

claudin-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLDN8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

claudin-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLDN8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLDN8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de claudin-8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLDN8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de claudin-8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie claudin-8 dans les cellules tumorales présentant une expression de CLDN8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.