Plasmide CRISPR d'Activation (h) CKIP-1: sc-403898-ACT

PLEKHO1 code la protéine 1 interagissant avec la caséine kinase 2 (CKIP-1), un adaptateur contenant un domaine d’homologie à la pleckstrine, qui se localise à la membrane plasmique et coordonne des interactions protéine–protéine contrôlant la transduction du signal et le renouvellement des protéines. CKIP-1 a été associée à la régulation de la signalisation Akt/PI3K et de processus dépendants de l’ubiquitine via des interactions avec des ligases E3 et des phosphatases, influençant ainsi la croissance cellulaire, la différenciation et l’organisation du cytosquelette. En biologie osseuse, CKIP-1 est impliquée dans la fonction des ostéoblastes et les voies de formation osseuse, tandis que des études plus larges associent une expression altérée de PLEKHO1 à des modifications des programmes de prolifération et de réponse au stress, pertinentes dans des contextes cancéreux et inflammatoires. Ces caractéristiques font de PLEKHO1 une cible utile pour disséquer les réseaux de signalisation proximaux à la membrane et les programmes transcriptionnels sous-tendant l’homéostasie tissulaire.

CKIP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLEKHO1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CKIP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLEKHO1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLEKHO1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CKIP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLEKHO1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CKIP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CKIP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PLEKHO1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.