Plásmido CRISPR de Activación (h) CHIP/STUB1: sc-400815-ACT

STUB1 codifica la ligasa E3 de ubiquitina CHIP, un co-chaperón que acopla el reconocimiento de clientes por HSP70/HSP90 con el recambio proteico dependiente de ubiquitina a través de sus dominios de repeticiones tetratricopeptídicas (TPR) y U-box. CHIP/STUB1 regula la proteostasis coordinando el control de calidad proteico, las decisiones de replegamiento mediadas por chaperonas y la degradación mediante el sistema ubiquitina–proteasoma, con efectos aguas abajo sobre las respuestas celulares al estrés y la homeostasis mitocondrial y del retículo endoplásmico (RE). A través de estos procesos, STUB1 influye en vías vinculadas a la agregación de proteínas y al mantenimiento neuronal, y la alteración de la actividad de CHIP/STUB1 se ha asociado con fenotipos de neurodegeneración y mecanismos patogénicos relacionados con la ataxia. Su papel central en el control de la carga de proteínas mal plegadas convierte a STUB1 en un nodo útil para estudiar la señalización del estrés y la estabilidad del proteoma en modelos de células humanas.

CHIP/STUB1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de STUB1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CHIP/STUB1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus STUB1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional STUB1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CHIP/STUB1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo STUB1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CHIP/STUB1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CHIP/STUB1 en células tumorales con expresión de STUB1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.