Cdt2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407212-ACT

Human DTL kodiert Cdt2, einen Substratrezeptor des CRL4^Cdt2‑E3‑Ubiquitin‑Ligasekomplexes, der die Zellzyklusprogression mit DNA‑Replikation und ‑Reparatur koordiniert. Cdt2 fördert die Treue der S‑Phase, indem es zentrale Faktoren der Replikationslizenzierung und der Checkpoint‑Kontrolle – darunter CDT1, p21 (CDKN1A) und SETD8 – während der DNA‑Synthese und nach genotoxischem Stress einer PCNA‑abhängigen Ubiquitinierung und anschließendem proteasomalen Abbau zuführt. Über diese Funktionen beeinflusst es die Kontrolle von Replikationsursprüngen, die Genomstabilität und die Signalübertragung der DNA‑Schadensantwort. Eine fehlregulierte DTL/Cdt2‑Aktivität wurde in krebsrelevanten Kontexten mit proliferativen Phänotypen und veränderter Checkpoint‑Kontrolle in Verbindung gebracht und stellt daher einen hilfreichen Knotenpunkt dar, um onkogenen Replikationsstress und Vulnerabilitäten des Zellzyklus zu untersuchen.

Cdt2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DTL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdt2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DTL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DTL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdt2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DTL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdt2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdt2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DTL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.