Plásmido CRISPR de Activación (h) Cdc50A: sc-403231-ACT

TMEM30A codifica la subunidad humana Cdc50A de los complejos flippasa de fosfolípidos P4-ATPasa, que mantienen la asimetría de los fosfolípidos de la membrana plasmática al translocar aminofosfolípidos a través de las bicapas. Al favorecer el tráfico vesicular, la endocitosis y el reciclaje de proteínas de membrana, Cdc50A influye en la polaridad celular, en la señalización apoptótica vinculada a la exposición de fosfatidilserina y en los microdominios de señalización dependientes de lípidos. La alteración de la homeostasis lipídica dependiente de TMEM30A/Cdc50A se ha asociado con cambios en el recambio de receptores, respuestas inflamatorias y fenotipos de estrés celular relevantes para la neurobiología, la inmunidad y la remodelación de membranas asociada al cáncer. Estas funciones hacen de Cdc50A un punto de entrada útil para estudiar la asimetría de membrana, las vías de tráfico y las redes de señalización reguladas por lípidos en células humanas.

Cdc50A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TMEM30A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cdc50A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TMEM30A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TMEM30A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cdc50A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TMEM30A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cdc50A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cdc50A en células tumorales con expresión de TMEM30A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.