Plásmido CRISPR de Activación (m) Calpastatin: sc-419474-ACT

Mouse Cast codifica calpastatina, el inhibidor endógeno de las proteasas calpaínas dependientes de calcio, que limita la proteólisis restringida de sustratos del citoesqueleto y de señalización. Al ajustar la actividad de las calpaínas, la calpastatina ayuda a regular la remodelación del citoesqueleto, el recambio de adhesiones focales, el tráfico de membranas y la apoptosis, con efectos posteriores sobre la señalización inflamatoria y las respuestas al estrés. El equilibrio CAST–calpaína es ampliamente relevante para la integridad tisular en el músculo y el sistema nervioso, y su desregulación se ha vinculado en la literatura con mecanismos subyacentes a la miopatía, la neurodegeneración y la activación alterada de células inmunitarias. En modelos celulares y animales, la modulación de la expresión de Cast se utiliza para analizar programas de remodelación impulsados por proteasas y redes de señalización dependientes de calcio.

Calpastatin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cast sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Calpastatin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cast en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cast, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Calpastatin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cast y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Calpastatin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Calpastatin en células tumorales con expresión de Cast silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.