Plasmide CRISPR d'Activation (h) BBS2: sc-404725-ACT

BBS2 code une sous-unité essentielle du complexe BBSome, un manteau multimérique qui régule le trafic des protéines membranaires ciliaires et la capacité de signalisation du cil primaire. Grâce à des interactions avec la machinerie de transport intraflagellaire et de petites GTPases, BBS2 contribue à coordonner l’export et l’import de cargos ainsi que la localisation des récepteurs, influençant des voies telles que Hedgehog et d’autres programmes de signalisation dépendants des cils. La perturbation de BBS2 altère la ciliogenèse et le transport ciliaire, entraînant une homéostasie cellulaire modifiée dans les tissus qui dépendent de la signalisation ciliaire. Des variants de BBS2 sont impliqués dans le syndrome de Bardet–Biedl et des phénotypes de ciliopathies apparentés, ce qui en fait une cible utile pour étudier les mécanismes des maladies médiées par les cils.

BBS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BBS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BBS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BBS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BBS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BBS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BBS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BBS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BBS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de BBS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.