ATGL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401711-ACT

PNPLA2 kodiert die Adipose-Triglycerid-Lipase (ATGL), das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für die initiale Hydrolyse von in zytosolischen Lipidtröpfchen gespeicherten Triacylglycerolen. Dabei entstehen Diacylglycerol und freie Fettsäuren, die der mitochondrialen β-Oxidation und dem zellulären Energiehaushalt dienen. Die ATGL-Aktivität verknüpft die Dynamik von Lipidtröpfchen mit Netzwerken der Nährstoffsensorik und metabolischen Signalübertragung, einschließlich PPAR-gesteuerter Transkriptionsprogramme sowie der lipolytischen Regulation durch Kofaktoren wie ABHD5/CGI-58 und inhibitorische Proteine wie G0S2. Eine dysregulierte PNPLA2-Expression oder eine gestörte ATGL-Funktion beeinträchtigt den Triglyceridumsatz und den Fettsäurefluss und trägt zu veränderter Lipidspeicherung, lipotoxischem Stress und metabolischen Phänotypen bei, wie sie in Fettgewebe, Leber, Herz und Skelettmuskel beobachtet werden. Als zentraler Knotenpunkt im Abbau neutraler Lipide wird PNPLA2/ATGL in Modellen von Lipidspeicherkrankheiten, in Signalwegen der Insulinresistenz und in zellulären Antworten auf Nährstoffmangel umfassend untersucht.

ATGL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PNPLA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATGL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PNPLA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PNPLA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATGL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PNPLA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATGL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATGL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PNPLA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.