Plasmide CRISPR d'Activation (h) ASS1: sc-401923-ACT

ASS1 humain (argininosuccinate synthase 1) code une enzyme cytosolique qui catalyse la condensation dépendante de l’ATP de la citrulline et de l’aspartate pour former l’argininosuccinate, une étape centrale du cycle de l’urée et de la biosynthèse de l’arginine. En régulant l’élimination de l’azote et la disponibilité de l’arginine, ASS1 influence l’homéostasie cellulaire des acides aminés, le métabolisme du monoxyde d’azote et, en aval, la synthèse des polyamines. Une expression altérée d’ASS1 est associée à des dysfonctionnements héréditaires du cycle de l’urée et peut remodeler les dépendances métaboliques des cellules tumorales, où l’auxotrophie à l’arginine et une reprogrammation du métabolisme à un carbone et des nucléotides sont fréquemment observées. Ces caractéristiques font d’ASS1 un point d’entrée pertinent pour étudier la régulation des voies métaboliques, les réponses au stress nutritionnel et les relations génotype–phénotype dans des modèles cellulaires humains.

ASS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ASS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ASS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ASS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASS1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ASS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASS1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASS1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ASS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.