ARA70 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424185-ACT

Maus-Ncoa4 kodiert ARA70, einen Koaktivator von nukleären Rezeptoren, der Transkriptionsprogramme moduliert, indem er ligandaktivierte Rezeptoren mit dem Chromatin und der basalen Transkriptionsmaschinerie verbindet. ARA70 beeinflusst die hormonresponsive Genexpression, einschließlich Signalwege, die mit der Androgenrezeptor-Signalgebung verknüpft sind, sowie allgemeinere, von nukleären Rezeptoren abhängige Stoffwechsel- und Differenzierungsprozesse. NCOA4 wird zudem mit der Eisenhomöostase in Verbindung gebracht, unter anderem über Funktionen im Zusammenhang mit dem Ferritin-Umsatz, wodurch Transkriptionsregulation mit zellulären Stressantworten gekoppelt wird. Eine Fehlregulation der NCOA4/ARA70-Aktivität wurde in Zusammenhängen veränderter endokriner Signalgebung, der Kontrolle der Zellproliferation und eisenstoffwechselassoziierter Phänotypen untersucht, die für die Krankheitsbiologie relevant sind.

ARA70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ncoa4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARA70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ncoa4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ncoa4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARA70-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ncoa4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARA70-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARA70-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ncoa4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.