Apaf-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401291-ACT

APAF1 codifica il fattore attivante la proteasi apoptotica 1 (Apaf-1), una piattaforma centrale nella via intrinseca mitocondriale dell’apoptosi. In seguito al rilascio del citocromo c e al legame di dATP/ATP, Apaf-1 oligomerizza formando l’apoptosoma, che recluta e attiva la caspasi iniziatrice 9, propagando a valle le cascate di caspasi che regolano la morte cellulare programmata. Questo nodo integra segnali di stress cellulare, la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e vie di checkpoint che governano l’omeostasi tissutale e il turnover cellulare durante lo sviluppo. Un’attività deregolata di APAF1 è stata associata a una competenza apoptotica alterata in ambito oncologico e in modelli legati alla neurodegenerazione, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sul controllo del destino cellulare.

Apaf-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APAF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Apaf-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APAF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APAF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Apaf-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APAF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Apaf-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Apaf-1 nelle cellule tumorali con espressione di APAF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.