ANT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400680-ACT

SLC25A5 kodiert die Adeninnukleotid-Translokase 2 (ANT2), einen Carrier der inneren Mitochondrienmembran, der zytosolisches ADP gegen ATP aus der Matrix austauscht und damit die oxidative Phosphorylierung an den zellulären Energiebedarf koppelt. Durch die Regulation des Adeninnukleotidflusses und des mitochondrialen Membranpotenzials beeinflusst ANT2 die bioenergetische Homöostase, das Redoxgleichgewicht und die Anfälligkeit für stressassoziierte Reaktionen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore. Die ANT2-Aktivität steht mit metabolischer Reprogrammierung und proliferativen Zuständen in Verbindung; eine veränderte Expression wird im Kontext des Tumorstoffwechsels und anderer Erkrankungen mit mitochondrialer Dysfunktion untersucht. Als X‑chromosomal kodierter Solute-Carrier ist SLC25A5 außerdem relevant für Untersuchungen zur gewebespezifischen Energienutzung und zu kompensatorischen Signalwegen zwischen ANT-Isoformen.

ANT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC25A5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC25A5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC25A5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC25A5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC25A5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.