adenosine deaminase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402201-ACT

Humanes ADA kodiert die Adenosin-Deaminase, ein Enzym des Purin-Salvage-Stoffwechsels, das Adenosin und Desoxyadenosin irreversibel zu Inosin bzw. Desoxyinosin desaminiert und damit die intra- und extrazellulären Purin-Pools prägt. Durch die Kontrolle der Spiegel immunmodulatorischer Nukleoside beeinflusst ADA den Nukleotidstoffwechsel, die Lymphozytenentwicklung und eine umfassendere zelluläre Homöostase, die mit DNA-Replikation und Stressantworten verknüpft ist. Eine dysregulierte ADA-Aktivität stört das Puringleichgewicht und die zugehörige Signalübertragung; ADA wird daher häufig in Kontexten untersucht, in denen Immunzellfunktion und metabolisches Remodeling zusammenkommen. Das macht ADA zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Zusammenspiel zwischen Purinstoffwechsel und Immunsystem sowie die nukleosidgetriebene Regulation von Genexpressionsprogrammen zu untersuchen.

adenosine deaminase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

adenosine deaminase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen adenosine deaminase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von adenosine deaminase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des adenosine deaminase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.