Plasmide CRISPR d'Activation (h) 3PGDH: sc-401405-ACT

Le gène humain **PHGDH** code la 3‑phosphoglycérate déshydrogénase (3PGDH), première enzyme et étape limitante de la voie de biosynthèse **de novo** de la sérine, qui détourne l’intermédiaire glycolytique 3‑phosphoglycérate vers la **L‑sérine** et, en aval, vers le métabolisme **à un carbone**. En contrôlant les pools de sérine et de glycine, PHGDH influence la synthèse des nucléotides, les réactions de méthylation et l’équilibre rédox cellulaire via un métabolisme couplé au **NADH/NADPH**. Une dérégulation de PHGDH a été associée à une reprogrammation métabolique dans des états prolifératifs ainsi qu’à des phénotypes neurométaboliques où la disponibilité en sérine limite des processus biosynthétiques liés aux protéines, aux lipides et aux neurotransmetteurs. En tant que nœud de voie reliant la glycolyse aux flux des acides aminés et du cycle des folates, la 3PGDH est fréquemment étudiée dans des travaux portant sur la dépendance aux nutriments, la communication métabolique mitochondrie–cytosol et l’adaptation au stress.

3PGDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PHGDH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

3PGDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PHGDH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PHGDH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 3PGDH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PHGDH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 3PGDH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 3PGDH dans les cellules tumorales présentant une expression de PHGDH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.