Plásmido CRISPR de Activación (h) Y14: sc-403255-ACT

RBM8A codifica la proteína humana de unión a ARN Y14, un componente central del complejo de unión a exones (EJC) que se deposita en el ARNm después del empalme y coordina etapas posteriores del metabolismo del ARN. Y14 participa en la degradación de ARNm mediada por codones sin sentido (NMD), la exportación de ARNm y la regulación de la traducción, influyendo así en el control de calidad de los transcritos y en la homeostasis de la expresión génica. A través de estas funciones, RBM8A repercute en vías relacionadas con la progresión del ciclo celular, la regulación génica del desarrollo y el procesamiento del ARN en respuesta al estrés. La desregulación de la actividad del EJC y de la vigilancia de ARN asociada a RBM8A se ha vinculado con un empalme aberrante y una estabilidad alterada de los transcritos observadas en múltiples contextos relevantes para enfermedades, incluidos programas de expresión génica neurodesarrollativos y asociados al cáncer.

Y14 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RBM8A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Y14 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RBM8A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RBM8A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Y14. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RBM8A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Y14 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Y14 en células tumorales con expresión de RBM8A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.