Plásmido CRISPR de Activación (h) XPA: sc-401483-ACT

La XPA humana codifica un factor central de reconocimiento del daño en el ADN dentro de la vía de reparación por escisión de nucleótidos (NER), que verifica lesiones que distorsionan la doble hélice y coordina el reclutamiento de TFIIH, RPA y ERCC1–XPF para permitir la doble incisión y la síntesis de reparación. Al actuar como andamiaje de complejos de reparación en fotoproductos inducidos por UV y aductos químicos voluminosos, XPA ayuda a preservar la integridad del genoma durante la replicación y la transcripción. La alteración o la reducción de la actividad de XPA compromete la capacidad de la NER, aumentando la carga mutacional y la sensibilidad celular al estrés genotóxico. La disfunción de XPA se asocia con el xeroderma pigmentoso del grupo A y se utiliza con frecuencia en estudios de deficiencia en reparación del ADN, mutagénesis y señalización de respuesta al estrés.

XPA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de XPA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

XPA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus XPA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional XPA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de XPA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo XPA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de XPA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía XPA en células tumorales con expresión de XPA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.